在试验条件（包含试剂）较难保证稳定的情况下，这种判别法较为适宜。在得出标本（S）和阴性对照（N）的A值后，核算S/N值。也有写作P/N的，这里的P不代表阳性（positive），而是病（patient）的缩写，不该误解。为防止混杂，更宜用S/N表示。在早期的间接法ELISA试剂盒中，有些作者定出S/N为阳性规范，现多为各种测定所沿袭。
实际上每一测定体系应该用试验求出各自的S/N的阈值。更应留意的是，N所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较底的缓冲液，致使反响后发生的本底也许较正常人血清的本底低得多。阳性断定值（cut-off value）通常为阴性对照A值加上一个特定的常数，以此作为判别结果阳性或阴性的规范。ELISA试剂盒用此法判别结果请求试验条件非常稳定，阳性和阴性的对照品应契合必定的标准，须配用精密的仪器，并严厉按规定操作。阳性断定值公式中的常数是在这特定的体系中经过对很多标本的试验检查而得到的。
现举某种检查HBsAg的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照品为不含HBsAg的复钙人血浆，阳性对照品HBsAg的含量标明为P=9±2ng/ml。每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值后，先核算阴性对照A值的平均数（NCX）和阳性对照A值的平均数（PCX），两个平均数的差（P-N）有必要大于一个特定的数值（例0.400），试验才有用。3个阴性对照A值均应≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此规模，则弃去，罢了另两个阴性对照从头核算NCX；如有两个阴性对照A值超出以上规模，则该次试验无效。阳性断定值按下式核算：
阳性断定值=NCX+0.05 标本A值＞阳性断定值的为阳性，小于阳性断定值的为阴性。应留意的是，式中0.05为该试剂盒的常数，只适合于该特定条件下，ELISA试剂盒而不是对各种试剂均可通用。