怎样选择泛素化抗体？看高手套路

上次跟大家谈到《如何得到可靠的泛素化数据》，今天继续泛素话题，一起了解下泛素化抗体。

 

图1：不同类型的泛素化

 

我们都知道，抗体与许多问题相关联。在研究中，选择合适的抗体至关重要！对于泛素抗体的选择，我们需要注意哪些呢？

 

天然或变性泛素？

 

如果购买的抗体是免疫天然泛素蛋白获得的，那么需要确保蛋白样本不会在测定过程中变性，否则会破坏信号。另一方面，泛素是难以变性的小球状蛋白。如果它在SDS-PAGE步骤中没有足够变性，那么能识别变性泛素蛋白的抗体可能不会识别它。

 

如果你正在寻找一种变性蛋白，你可以在一抗孵育之前，通过对PVDF膜进行变性处理，增加WB信号强度。这种方法听起来似乎不靠谱，但确实是行得通的。具体操作如下：

 

1. 将印迹在沸水中孵育15-30分钟；

2. 20mM Tris-HCl，pH7.5，5mM β-巯基乙醇和6M盐酸胍溶液中4℃孵育30分钟。

 

单聚或多聚泛素？

 

大多数泛素抗体可以结合单泛素链和多泛素链。能特异性识别多聚泛素链的抗体已经问世，但是似乎不能均等地识别不同的泛素链。一项研究表明，来自Dako的抗Ub抗体不识别多泛素链中的M1链及K48和K63链，而来自Cell Signaling Technology的抗Ub抗体几乎不能识别M1链。显然，如果目标蛋白上的泛素链较少被识别，那么所得到的信号就会减少。

 

如果你想检查特定的多聚泛素链，很多已开发的抗体都能满足你的要求。抗K6，K11，K33，K48和K63都可以买到现货，似乎已经得到相当不错的评论。 抗M1，K27和K29的抗体目前还不存在，你或许会成为开发此类抗体的第一人？

 

如果你找不到合适的抗体或先前使用的抗体效果不理想，那么你可以使用特定的泛素结合域（ubiquitin binding domains）识别你感兴趣的泛素化蛋白。ubiquitin binding domains 可固定用于下拉或用作探针。