PCR扩增制备带标记探针

实验步骤

1. 生物素标记

应用bio-11-dUTP部分替代dTTP搀入PCR扩增探针中

   1) 配制反应体系

dNTP的组成  dATP、dCTP、dGTP各20mmol，dTTP 15mmol，bio-11-dUTP 5mmol混匀，其他试剂如常规PCR。

   2) 25循环后，冻存，取出化冻，趁下层水相尚在冰冻状态，吸尽石蜡油

   3) 水相中20mg/ml糖原1ul，pH5.2 2.5MnaAC10ul，220ul无水乙醇。混匀后－20℃过夜

   4) 离心取沉淀，冷冻干燥后100ul水或TE复溶。

2. 地标记

应用dig-11-dUTP部分替代dTTP搀入PCR扩增探针中

   1) 配制反应体系

dNTP的组成  dATP、dCTP、dGTP各200umol，dTTP 130umol，bio-11-dUTP 70umol混匀，其他试剂如常规PCR。

   2) 35循环扩增产物

30 扩增产物纯化与DIG随机标记探针方法相同（仅沉淀时，50ulPCR反应液中加入5ul4MliCl和150ul冰乙醇）。

注意事项

1. 标记时标记基团在dNTP中占的比例不能太高，因标记基团与dTTP相比具位阻效应，比例太高PCR扩增及以后的杂交都要受到影响。

2. 靶DNA用量不能太高，生物素标记中控制在0.2fmol左右；地高标记中可低至0.1ng。