为什么别人的western blot做起来很简单？

为什么我总是做不出结果，

到底是什么问题？是一抗还是二抗有问题

一、什么是内参

内参及时内部参照(Internal Control),对于哺乳东西细胞来说一般是指有管家基因编码表达的蛋白（Housekeeping Proteins），它们在各组织和细胞中表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物，

二、为什么要使用内参

再Western Blotting中使用内参其实就是再WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样再检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参再各组织和细胞中表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果，才更为可信，此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全，整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

 三、如何归一化WB结果？

WB可用于蛋白半定量，需要将数据归一化（normalize）来比较多个样品目标蛋白的相对表达,具体方法如下：

1、通过灰度值分析测定每个蛋白的条带强度；

2、目标蛋白的条带强度除以内参的条带强度，已减少样品间变化的影响。

3、比较所有泳道上目标的相对表达量以评估样品中目标蛋白表达的变化。

 四、选择内参抗体需要考虑的因素

一、分子大小

内参蛋白分子大小（kDa）的选择非常重要，与目标蛋白相比，内参蛋白应该要足够大或足够小，以便与目标蛋白区分，如果目标蛋白和内参蛋白大小相当的话，WB结果无法直接观察，很难进行准确数据的分析，

 

二、线性范围及上样量

线性范围是条带强度与膜上目标蛋白表达成比例的区域，过高或过低的上样量都会产生误差。很多情况下，目的蛋白的表达量相较于内参来说非常低，常常需要加大上样量，但是，这时内参表达量就会超出线性范围。超载的凝胶，在所有的泳道上表现出相同的条带强度，这种检测无疑是不准确的。

 

因此，建议先确定样本的线性范围，可稀释样本来创建标准曲线，根据标准曲线来鉴定饱和点和所需的总蛋白量。

 

三、表达强度及稳定性

确保选择的内参再样品中高表达，大多数常用的内参蛋白是由保守基因高表达的，这些保守基因是细胞发育及维持细胞活力所必须的。

此外，还应该选择表达不受实验变量影响的内参，最佳的内掺应当不受样本来源、实验条件的影响。比如，GAPDH不适用于氧相关研究，因为缺氧可能上调比如GAPDH的表达。

四、样本种属来源

首先要考虑的就是实验样本来源于什么物种。

(1)哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,Katpase等。

(2)植物来源实验样本，则可以选择plant actin、Rubisco等。

(3)其他来源样本研究较少，所以就应该参照文献报导，选择合适的蛋白作为内参。

五、目的蛋白分子量

beta Actin、beta Tubulin、GAPDH 的分子量分别是 42kd，50kd，37kd，目的蛋白分子量最好能与内参蛋白分子量相差 5kd 以上，才能分开目的蛋白和内参，

六、目的蛋白表达部位

就一般的蛋白检测来说，β-actin、β-Tubulin抗体等就可以了，而针对于核蛋白的定量，特别是样本蛋白就是核蛋白时，选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常见的核蛋白内参还有PCNA、K70、K80等，在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而对于膜蛋白检测，常用的内参抗体为Na,K ATPase。对于线粒体蛋白的检测，常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。

 

五、常用的三大内参

1、beta Actin

肌动蛋白，细胞骨架蛋白。他们在各组织和细胞中的表达相对恒定，再检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物，beta Actin作为内参是的到公认的，针对大多数组织和细胞来说，它广泛分布于细胞质内，表达量非常丰富，但是再一些少量特殊的情况下比如脂肪组织和细胞内，beta Actin的表达量就很少。

2、GAPDH

甘油醛-3-磷酸脱氢酶，该酶是糖酵解反应中的一个酶，几乎在所有组织细胞中都高水平表达，在同种细胞或组织中的表达量一般是恒定的，且很少受外部诱导物的影响。但比如缺氧和糖尿病等疾病存在下，会增加 GAPDH 在特定细胞和组织中的表达。

3、beta Tubulin

微管蛋白，细胞骨架蛋白。作为内参抗体，beta Tubulin 表达通常不会发生改变，因此被广泛用于 Western Blot 内参，也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。

六、WB中如何使用内参？

一、简易标记法

只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可，

二、Steipping和Reprobing

确定内参表达的常用方法是Steipping和Reprobing，先进行目的蛋白的抗体孵育显色和检测，然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，再用内参特异性抗体重新检测。

在Strip之后，为了确认完全的抗体去除，膜应洗涤、封闭、然后用二抗染色。如果Strip完成，二抗将不产生检测信号，如果检测到信号，则必须优化Strip条件。

三、剪膜实验

当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以再转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开，然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行检测，

七、内参使用注意事项

1. 不同的内参在选择上也要根据具体的样本情况选择，没有一种内参能适用所有的组织和细胞样本。比如，血红细胞(因为其细胞结构的特殊性和需要携带氧气的功能性)样本就不适合以上 3 种常用内参。如果使用会导致结果很差或者没有结果。可以选用血红细胞的结构性蛋白作为内参代替。

2. 在做多组织多细胞样本对比表达量时，最好选用 GAPDH 作为内参，因为 GAPDH 是代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定。而 beta Actin 和 beta Tubulin 是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性，如脑组织的 tubulin 的表达会高一些(因为神经细胞的轴突和树突都由 tubulin 维持结构)，而 actin 的表达量可能会低一些。再比如，骨骼肌、心肌和平滑肌的特殊功能反而导致了 tubulin 的表达改变和特化。心肌的 beta Actin 的表达量可能变少，而 alpha Actin 表达量高。因为这些组织的差异，现在慢慢采用总 Actin 和总 tubulin 作为内参，可以尽量减少一些组织表达量差异。

3. 做各种分泌液样本的时候，如血浆，乳汁，组织液等，以上的 3 种内参也不是很合适。由于没有完整的细胞结构，所以只能选择一些分泌蛋白作为内参，或者采用其他方式作为内参。

4. 做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时，选择结构蛋白作为内参，如 beta Actin 和 beta Tubulin。因为 GAPDH 是代谢类蛋白，表达量有可能会受到诱导处理的影响。同时，做修饰性抗体的 Western Blot 实验，最好也带上同抗原的总抗作为阳性对照。