染色质免疫共沉淀（CHIP），是一种用于研究目的蛋白在染色质上定位的技术，虽然原理看起来很简单，单CHIP是一项非常有挑战的技术，很多因素都可能导致实验失败。

 

染色质免疫共沉淀（CHIP）技术

• 如何选择CHIP抗体？

• 没有足够的起始样怎么办？

• 如何对CHIP-sep进行精确定量

今天小编就为大家带来，CHIP实验的超全实验方法和经验总结，助你轻松闭坑。

#如何选择CHIP抗体？ 01单克隆还是多克隆抗体？

单克隆或多克隆抗体都可用于 ChIP 实验。

单克隆抗体只识别目的蛋白的单个表位，因此有非常高的特异性，和较低的非特异结合、较低的背景和杂带，而且生产批次稳定。但是单克隆抗体识别的表位可能位于蛋白与 DNA 结合位置或因联过程而被掩蔽，这种情况就导致抗体不能结合该表位导致实验失败，但这种情况通常极少出现。

多克隆抗体识别多个抗原表位，可以更有效地结合目的蛋白、成功率更高；但非特异结合也增加，导致杂带更多。多克隆抗体的生产批次不稳定。

02是否一定要选择ChIP级别的抗体？

ChIP 级别（ChIP Grade）的抗体对抗体纯度、特异性方面都比较高，是 ChIP 实验的最优选择。此外通过 ChIP 或 IP 测试的抗体也可以用于 ChIP-seq。尽量不要选择没有标注 ChIP 应用，或标注未检测的抗体，否则往往只会浪费时间。

优先选择大品牌的抗体，比如 abcam、merck millipore、CST 等品牌，可选的产品较多，批次之间的效果一致性也更有保障。组蛋白 H3K4me3、H3K9me3、H3K27ac 通常等都能找到商业化的可用于 ChIP、IP 抗体。

03其它应用测试的抗体作为备选

但是许多转录因子的抗体并不是 ChIP 或 IP 级别的抗体，在这种情况，也可以考虑标注了其他应用，如免疫荧光、免疫组织化学、流式细胞术的抗体。此时要尽量选择通过多种应用测试的抗体，这些抗体比仅通过 WB、ELISA 测试的抗体效果要好得多，相对更可能产生阳性的 ChIP 结果。

尽量选择通过多种应用测试的抗体，而非仅通过 WB、ELISA 测试的抗体。

04尝试使用近源物种的抗体

特殊物种没有商业化抗体、而相近的其他物种有抗体的情况，可比对目的蛋白序列在两个物种中的同源性，（可以用 NCBI 或 Swiss-Prot 数据库比对），若同源性在 80% 以上，就可以尝试跨物种使用该抗体。

#没有足够的起始样怎么办？ 

ChIP 是一项富集技术，不是纯化方法。大部分我们感兴趣的蛋白或组蛋白修饰分布在整个基因组，只是不同区域的富集度不同。因此，有意义的结果需要高效的富集。

传统的 ChIP 实验需要至少两百万细胞作为起始材料，这对于有些珍贵细胞样本是非常困难的。解决这个问题的关键是通过 ChIP 的 buffer 及条件优化，降低非特异性的背景，实现最优的信噪比。

针对这个问题，一方面通过 buffer 条件优化，提供高灵敏 ChIP 试剂盒，最少可用 1000 个细胞进行 ChIP 实验。另一方面，也提供低细胞量的 ChIP-Seq 服务，对于高丰度目标蛋白（如组蛋白修饰）仅需 10000 个细胞；对于低丰度目标蛋白（如转录因子），仅需 50000～500000 个细胞。

#如何对CHIP-sep进行精确定量？ 

在对不同样本的 H3K27me3 ChIP-seq 数据比较时，发现了一个有意思的问题。通过 H3K27me3 甲基转移酶 EZH2 的抑制剂处理细胞以后，免疫印迹检测结果表明，H3K27me3 整体水平显著下降。ChIP-qPCR 也检测到很多位点的 H3K27me3 水平有明显下调。

但用常规的 ChIP-seq 分析方法比较，并不能检测到 H3K27me3 水平的下降。造成这个结果的原因在于在标准的 ChIP-seq 实验过程中，文库构建需要的 PCR 扩增以及常规数据分析时对整体数据量的校正掩盖了样本间数据量的差异。

针对这一问题，Active Motif  凭借多年的 ChIP-seq 服务经验成功研发出「Spike-In」校正策略。标准的 ChIP 反应是使用样本染色质和抗体建立的。在「Spike-in」校正体系中，果蝇（Dropsophila）「Spike-in」染色质和识别果蝇染色质的抗体也被加入到反应体系中。因为果蝇的基因组和人的基因组同源性很低，在做测序分析的时候，它就可以作为内参，对整个 ChIP-seq 起到矫正作用。