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细胞技术课堂小知识——荧光免疫实验步骤
人阅读 发布时间:2023-07-28 17:36
贴壁细胞免疫荧光法
(1) 在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min。
(2) 4%多聚甲醛固定细胞爬片15min。
(3) 1XPBS洗涤3 次,每次5min。
(4) 0.5%Triton X-100 (PBS 配制)室温通透10min。
(5) 1×PBS 洗涤3 次,每次5min。
(6) 1%BSA室温封闭30min。
(7) 弃掉封闭液,细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗,4℃孵育过夜。
(8) 1 ×PBS 洗涤3 次,每次5min。
(9) 细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗。
(10) 1×PBS 洗涤3 次,每次5min。
(11)DAPI染细胞核,浓度和时间根据试剂说明书使用。
(12)1×PBS洗涤3 次,每次5min。
(13)用抗荧光淬灭剂封片。
(14)荧光显微镜下观察采集图像。
悬浮细胞免疫荧光法(一)
(1) 收集悬浮细胞,细胞在冰浴中冷却,然后用台式离心机于4℃以800 g离心5 min,吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。
(2) 离心吸去 PBS,4%多聚甲醛固定液,重悬细胞,置冰上固定30 min。
(3) 离心、吸去固定液,用4℃ 1×PBS重悬细胞,离心800 g 离心5 min,去PBS,留细胞沉淀。
(4) 0.5%Triton X-100 (PBS 配制)室温通透10min。
(5) 离心800 g离心5 min,去通透液,留细胞沉淀。
▲注意:步骤(4)和(5)用于检测细胞核抗原,细胞膜抗原直接跳过此步骤
(6) 使用1% BSA进行室温封闭30min,用于封闭非特异性抗原表位。
(7) 离心800 g离心5 min,去封闭液,留细胞沉淀。
(8) 孵育一抗,浓度根据抗体说明书操作,4℃摇床孵育过夜(一般孵育15-16h)。
(9) 用4℃ 1×PBS稀释细胞和抗体,离心,吸去PBS,以4℃ 1×PBS重悬细胞,重复1次。
(10) 吸去PBS,二抗孵育液(二抗浓度根据抗体说明书操作)重悬细胞,4℃温育30-60min,重复步骤(9)。
(11)避光条件下,DAPI染液染细胞核,浓度和时间根据试剂说明书使用。
(12)重复步骤(9)。
(13)用少量的PBS重悬细胞,然后用吸管铺到载玻片上,用盖玻片覆盖。( 14)使用荧光显微镜进行观察拍照。
悬浮细胞免疫荧光法(二)
(1) 悬浮生长细胞:取对数生长细胞,用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。把细胞片浸入95%乙醇或丙酮中固定。
(2) 1×PBS 洗涤3 次,每次5min。
(3) 0.5%Triton X-100(PBS配制)室温通透10min。
(4) 1×PBS 洗涤3 次,每次5min。
▲注意:步骤(3)和(4)用于检测细胞核抗原,细胞膜抗原直接跳过此步骤。
(5) 使用1% BSA进行室温封闭30min,用于封闭非特异性抗原表位。
(6) 按抗体推荐使用说明书孵育一抗,4°C湿盒中静置过夜。
(7) 次日取出细胞片,室温下复温30min。
(8) 1×PBS 洗涤3 次,每次5min。
(9) 选取相应的免疫荧光二抗滴加于细胞片上,37°C避光孵育30-60min。
(10)1×PBS洗涤3 次,每次5min。
(11)避光条件下,DAPI染液染细胞核,浓度和时间根据试剂说明书使用。
(12)1×PBS洗涤3 次,每次5min。
(13)在细胞片上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。
(14)使用荧光显微镜进行观察拍照。