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等温扩增 vs. PCR扩增,你pick谁?

人阅读 发布时间:2022-04-12 09:20

在对DNA样本进行测序之前,通常需要对其进行扩增。PCR是最为常用且广为人知的扩增方法,但还有另一种选择,那就是等温扩增(isothermal amplification)。温度是否变化,是等温扩增和PCR扩增之间的主要区别。

 

在PCR中,热循环仪反复改变反应温度,影响各种试剂的作用;相比之下,等温扩增方法则在单一温度下扩增DNA,它采用链置换DNA聚合酶,在沿着双链DNA移动时“解开”链,而不是像PCR那样采用热变性。

等温扩增方法有多种类型,包括链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、全基因组扩增(WGA)、环介导等温扩增(LAMP)、解旋酶依赖性扩增(HDA)和多重置换扩增(MDA)等。下面我们将介绍等温扩增和PCR扩增方法的特点以及如何选择。

 

#PCR VS 等温扩增 

 

扩增方法的选择通常取决于具体应用和现有设备。虽然PCR广泛用于扩增,但它需要使用热循环仪。对于实验室来说,这也许根本不算事儿,不过对于诊断应用而言,这可能就是个缺点。

如果有热循环仪,PCR扩增是一个相对简单的过程,对稀有转录本来说也是个更好的选择。相比之下,等温扩增特别适合那些无法使用热循环仪的情况,而且有时候更快速、更简单,也更经济。

与PCR相比,等温扩增的灵敏度或特异性有时比较低,但这可以通过优化反应来改善。等温扩增可能会受到非特异性的影响。

在某些情况下,两种方法的信息量是不同的。PCR专门检测感兴趣的目标,Tecan的单引物等温扩增(SPIA)则不同,它是一种全转录组方法,可帮助用户检测感兴趣的目标以及其他相关信息,如共存的病原体或宿主信息。

 

#等温桥式扩增 

 

还有一种特殊类型的等温扩增,被称为桥式扩增,应用在Illumina的新一代测序平台中。它可以扩增模板,生成数百万个序列簇,而且只需极少的手动操作。它与大多数等温扩增方法的不同之处在于它是循环进行的,采用变性剂来分离双链DNA(类似于PCR中的加热步骤)。

不过,“这种方法的缺点是,每个扩增循环都需要添加新鲜混合物(包含聚合酶),然后进行化学变性步骤,这使得它的成本远高于常规PCR,”Hegde说。

一种原位的固相等温扩增也许可以替代桥式扩增,应用于新一代测序中。它基于DNA复制的模板步移机制,在固体表面使用低熔点均聚物引物(如polyA),在溶液中使用低熔点模板引物。Hegde称:“这种方法简单快速,经济高效,且适用于双端测序。”

 

#等温扩增的应用 

 

等温扩增技术是不需要热循环系统,就可以进行核酸扩增。相比于常规PCR需要经过严格的高温变性、退火、延伸的等步骤才能模拟体外的DNA分子扩增,等温扩增技术使用的温度是恒温,不需要进行高温变性、退火等步骤就可以模拟体外DNA分子扩增,但仍然还是需要相应的引物、模板、相关聚合酶、核苷酸的条件下反应。

相比于其他核酸扩增技术具有高速、高效、特异性好等优点,此外,它不需要专用的设备。

随着分子生物技术的发展,现在基于等温扩增原理研发出来的新型核酸扩增技术主要有6种,分别是环介导等温扩增技术(LAMP)、重组酶聚合酶扩增技术(PRA)、交叉引物扩增(CPA)、链置换扩增(SDA)、滚轮扩增技术(PCA)、HDA解旋酶依赖性扩增技术。

 

#聚合酶链式反应(PCR) 

 

聚合酶链式反应(PCR)是利用耐高温的DNA聚合酶(Taq 酶),将模板DNA,引物,脱氧核苷三磷酸(dNTP)和缓冲液等在不同温度间循环,从而达到双链DNA分离,引物粘合到模板上的互补区间,最后在DNA聚合酶作用下脱氧核苷三磷酸逐个添加到新合成的DNA链上的过程。

PCR是利用DNA 在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基 互补配对的原则结合,再调温度 至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右),DNA聚合酶 沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能在变性温度,复性温度,延伸温度之间很好地进行控制。

 

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